ReadyAMP®PCR直接擴(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌16s rDNA鑒定中應(yīng)用表現(xiàn)
隨著分子學(xué)的發(fā)展,細(xì)菌16S rDNA序列的鑒定逐漸成為細(xì)菌特征的“金標(biāo)準(zhǔn)"。大部分實(shí)驗(yàn)室中正逐步使用該方法替代傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定等方法。16S rDNA因其序列在物種間的高度多樣性,成為細(xì)菌分類研究的“分子鐘",素有“細(xì)菌化石"之稱。
16S rDNA鑒定意義重大,主要體現(xiàn)在以下幾個方面:
1、測序結(jié)果和已知細(xì)菌16S rDNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,可以確定未知細(xì)菌的分類和物種關(guān)系。對臨床微生物和環(huán)境微生物意義重大。
2、通過比較不同細(xì)菌的16S rDNA序列,可以推測相互之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系,進(jìn)而了解細(xì)菌的進(jìn)化和演化史。
3、通過環(huán)境樣本中細(xì)菌16S rDNA序列比較,可以分析和總結(jié)出不同細(xì)菌在不同環(huán)境下對自然界的功能和作用。
4、菌落中16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行鑒定,可提供菌落組成、表達(dá)豐度、以及系統(tǒng)進(jìn)化分析。為菌落與環(huán)境、環(huán)境與人類的相互作用提供數(shù)據(jù)支持。
但是常規(guī)獲得16S rDNA序列的方法如圖1。實(shí)驗(yàn)室工作人員zui常用的細(xì)菌DNA提取試劑盒,也就是通用的離心柱式提取基因組
圖1 傳統(tǒng)離心柱提取和ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒對比
DNA。作為傳統(tǒng)且經(jīng)典方法,該方法對長期從事提取工作的實(shí)驗(yàn)室人員來說存在幾個難點(diǎn):
1、提取時間長達(dá)40-90分鐘
2、需要使用溶菌酶、蛋白酶K等酶類
3、需要使用多種設(shè)備,包括恒溫浴、離心機(jī)等
4、革蘭氏陽性菌產(chǎn)量低
針對以上痛點(diǎn)和難點(diǎn),我司開發(fā)了ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒,操作流程見圖1。該方法最大的特點(diǎn)如下:
1、簡單便捷、一步完成;
2、檢測線低至104個/mL細(xì)菌;
3、檢測樣本豐富,例如對數(shù)生長期菌液、菌斑、甘油菌等;
4、樣本需求量低,例如菌液/甘油菌1-3μL、菌斑1個;
5、革蘭氏陰性菌100%檢出;
6、革蘭氏陽性菌99.99%檢出;
7、難培養(yǎng)樣本有效;
8、珍貴樣本有效;
已驗(yàn)證的細(xì)菌包括:
案例A——對數(shù)生長期細(xì)菌快速擴(kuò)增16S rDNA
以對數(shù)生長期菌液為模板,使用ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒(貨號Nu-16S01)擴(kuò)增16S rDNA,以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照。
案例B——單菌落快速擴(kuò)增16S rDNA
以對單菌置生理鹽水中為模板,使用ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒(貨號Nu-16S01)擴(kuò)增16S rDNA,以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照。
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