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近年來(lái)，為盡可能的模仿細(xì)胞在生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，得到更接近類似于體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞, 越來(lái)越多研究人員開(kāi)始關(guān)注三維細(xì)胞、類器官培養(yǎng)技術(shù)。

以下為大家介紹Biozellen 3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠的使用步驟：

A、試劑制備

A 基質(zhì)膠：將 A 基質(zhì)膠溶于 37℃水浴槽回溫 10 分鐘， 確認(rèn)融解.

C 緩沖溶液(1X)制備：使用將 10X C 緩沖溶液用冰的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液(例如： 無(wú)血清 DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D 類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：

1. 將 24 孔培養(yǎng)板放置于冰箱或者冰上預(yù)冷。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5ml 37℃ 培養(yǎng)基均勻混合，并與 0.5ml 37℃ A 膠按照 1:1 等比例均勻混合，終細(xì)胞密度 1*105~1*107cells/mL。

注：請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3.取 20-40 微升步驟 2 含細(xì)胞的混合 A 膠溶液滴于 步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。

注: 測(cè)試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4.待膠體成膠后，添加 1 毫升冰的 1X C 緩沖溶液，并蓋過(guò)步驟 3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5.待 15 分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長(zhǎng)之培養(yǎng)基溶液。

6 將含有細(xì)胞的膠于 37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行 7~14 天的培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用 1X PBS 進(jìn)行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 緩沖溶液，蓋過(guò)膠滴于室溫反應(yīng) 5 分鐘。

溫和的用 1 毫升移液管吸取，直到膠滴溶解。

將含有細(xì)胞球體的溶液吸入 1.5 毫升離心管，用 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。

D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1. 添加 trypsin-EDTA 并與收集的細(xì)胞球體于 37°C 混合反應(yīng)。

2. 用 1 毫升移液管混合，直到細(xì)胞體分解。

3. 待細(xì)胞球體分解，加入 3 倍體積的 1X PBS，并用 1000 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心 10 分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。