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全面了解線粒體功能

1、實(shí)驗(yàn)背景

 安捷倫 SeahorseXF 細(xì)胞線粒體壓力測試通過在 Seahorse XFe 和 XF 細(xì)胞外流量分析儀上直接測量細(xì)胞的氧消耗速率（OCR）來表征線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。它是基于培養(yǎng)板的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，能夠?qū)崟r監(jiān)測 OCR。   

   實(shí)驗(yàn)使用 XF 傳感器探針板內(nèi)置的加藥孔在實(shí)驗(yàn)過中將呼吸作用的調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞孔中，從而得到反映線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)。實(shí)驗(yàn)試劑盒里的調(diào)節(jié)劑為寡霉素（Oligomycin），羰基氰-4（三氟甲氧基）苯腙（Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy)Phenylhydrazone，F(xiàn)CCP），魚藤酮（Rotenone）和kang霉素 A（Antimycin A）。

圖1  安捷倫SeahorseXF細(xì)胞線粒體壓力測試曲線，展示線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)

圖 2  安捷倫 SeahorseXF 細(xì)胞線粒體壓力測試 ETC 的調(diào)節(jié)劑，闡述電子傳遞鏈（ETC）復(fù)合物，并顯示 Seahorse XF細(xì)胞線粒體壓力測試試劑盒包含的所有調(diào)節(jié)劑的作用靶點(diǎn)。

寡霉素抑制 ATP 合酶（復(fù)合物 V），是實(shí)驗(yàn)中在基礎(chǔ)測量之后一次注射的化合物。它影響或減少通過 ETC 的電子流，導(dǎo)致線粒體呼吸或 OCR  減少。減少的 OCR 與細(xì)胞 ATP 的產(chǎn)生相關(guān)。

羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）是一個解偶聯(lián)劑，它破壞質(zhì)子梯度和線粒體膜電位。它是寡霉素后第二次注射的化合物。加入的結(jié)果是，通過ETC的電子流不受限制，復(fù)合物IV耗氧量達(dá)到大。FCCP激發(fā)的OCR可用來計(jì)算備用呼吸能力，它的定義是大呼吸和基礎(chǔ)呼吸的差值。備用呼吸能力衡量細(xì)胞對增加的能量需求或壓力的反應(yīng)能力。

第三次注射的是復(fù)合物I的抑制劑魚藤酮和復(fù)合物III的抑制劑kang霉素A的混合物。它們聯(lián)合關(guān)閉了線粒體呼吸，從而能夠計(jì)算由線粒體外的過程驅(qū)動的非線粒體呼吸。

表1總結(jié)了這些化合物的作用效果。 

表1線粒體呼吸調(diào)節(jié)劑作用靶點(diǎn)和效果總結(jié)

 對線粒體功能進(jìn)行評估使研究人員能夠進(jìn)一步了解代謝在細(xì)胞生理學(xué)，疾病病理學(xué)和病因?qū)W中的關(guān)鍵作用。

 SeahorseXF細(xì)胞線粒體壓力測試是測量細(xì)胞線粒體功能的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)為了解線粒體功能障礙的原因和深入理解代謝途徑，信號和表型提供了視角。

詞匯表：

· 基礎(chǔ)呼吸（Basal respiration）：用來滿足細(xì)胞ATP需求和線粒體質(zhì)子滲漏的氧消耗。表示細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的能量需求。

· ATP產(chǎn)生（ATP Production）：加入ATP合酶抑制劑寡霉素后減少的氧氣消耗速率，代表基礎(chǔ)呼吸中被用來驅(qū)動ATP產(chǎn)生的部分。表示用來滿足細(xì)胞能量需求的線粒體ATP產(chǎn)生。

· H+（質(zhì)子）滲漏（H+ (Proton) leak）：與 ATP產(chǎn)生不偶聯(lián)的基礎(chǔ)呼吸的剩余部分。質(zhì)子滲漏可以被看作是線粒體損傷的標(biāo)志，也可被看作是一種調(diào)節(jié)線粒體ATP產(chǎn)生的機(jī)制。

· 大呼吸（Maximal respiration）：加入解偶聯(lián)劑FCCP之后獲得的大氧氣消耗速率。FCCP通過刺激呼吸鏈以大能力運(yùn)轉(zhuǎn)模擬生理的“能量需求”，導(dǎo)致底物（糖，脂肪和氨基酸）的快速氧化以應(yīng)對這一代謝挑戰(zhàn)。顯示細(xì)胞能夠達(dá)到的大呼吸速率。

· 備用呼吸能力（Spare respiratory capacity）：這個測量指標(biāo)表示細(xì)胞應(yīng)對能量需求的能力以及細(xì)胞呼吸與其理論大值的差距。細(xì)胞應(yīng)對能量需求的能力可作為細(xì)胞適應(yīng)性或靈活性的一個指標(biāo)。

· 非線粒體呼吸（Nonmitochondrial respiration）：加入魚藤酮和kang霉素A后，由于一部分細(xì)胞中的酶繼續(xù)消耗氧而存留的氧消耗。這對于線粒體呼吸的準(zhǔn)確測量很重要。

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